Kloniranje gena je čin stvaranja kopija, ili klonova, jednog gena. Kada se identificira gen, klonovi se mogu koristiti u mnogim područjima biomedicinskog i industrijskog istraživanja. Genetski inženjering je proces kloniranja gena u nove organizme ili promjenu DNA sekvence za promjenu proteinskog proizvoda. Genetski inženjering ovisi o našoj sposobnosti da izvršimo sljedeće bitne postupke.
Reakcija lančane polimeraze
02 restrikcijskim enzimima
Otkriće enzima poznatih kao restrikcijske endonukleaze bitno je za protein inženjering . Ovi enzimi odrežuju DNA na određenim mjestima na osnovi nukleotidne sekvence. Stotine raznih restrikcijskih enzima , sposobnih za rezanje DNA na određenom mjestu, izolirani su iz mnogih različitih sojeva bakterija. DNA izrezana s restrikcijskim enzimom proizvodi mnogo manjih fragmenata različitih veličina. One se mogu razdvojiti pomoću gel elektroforeze ili kromatografije.
Elektroforeza
Pročišćavanje DNK iz stanične kulture ili njegovo rezanje pomoću restrikcijskih enzima ne bi bilo puno koristi ako ne možemo vizualizirati DNK - to jest pronaći način da vidimo da li vaš ekstrakt sadrži ništa ili kakvu veličinu fragmentiraju Izrezao sam je. Jedan od načina za to je gel elektroforeza. Gelovi se rabe za različite svrhe, od gledanja DNA rezanja u otkrivanje DNK umetaka i kuka.
Pridružite se dva dijela DNA
U genetskim istraživanjima često je potrebno povezati dva ili više pojedinačnih niti DNK, stvoriti rekombinantni lanac ili zatvarati kružnu nit koja je izrezana s restrikcijskim enzimima. Enzimi koji se nazivaju DNA ligaze mogu stvoriti kovalentne veze između nukleotidnih lanaca. Enzimi DNA polimeraza I i polinukleotidna kinaza također su važni u ovom procesu, za punjenje praznina ili fosforilaciju 5 'krajeva, respektivno.
05 Izbor malih DNK koji se replicira
Mali kružni dijelovi DNA koji nisu dio bakterijskog genoma, ali sposobni za samo-replikaciju, poznati su kao plazmidi. Plazmidi se često koriste kao vektori za transport gena između mikroorganizama. U biotehnologiji, kada je gen od interesa pojačan i oba gena i plazmid su odsječeni restrikcijskim enzimima, oni se ligiraju zajedno stvarajući ono što je poznato kao rekombinantna DNA. Virusna (bakteriofagenska) DNA može se također koristiti kao vektor, kao i kozmidi, rekombinantni plazmidi koji sadrže bakteriofage.
Metoda za premještanje vektora u stanicu domaćina
Proces prijenosa genetskog materijala na vektor kao što je plazmid, u nove stanice domaćina, naziva se transformacija. Ova tehnika zahtijeva da su stanice domaćina izložene promjeni okoliša što ih čini "kompetentnim" ili privremeno propusnim za vektor. Elektroporacija je jedna takva tehnika. Što je plazmid veći, to je niža učinkovitost s kojom ga prenose stanice. Veći dijelovi DNA lakše se kloniraju upotrebom bakteriofaga, retrovirusa ili drugih virusnih vektora ili kozmida u metodi koja se naziva transdukcija. Fagi ili virusni vektori često se koriste u regenerativnoj medicini, ali mogu uzrokovati umetanje DNA u dijelove naših kromosoma, gdje ne želimo, uzrokujući komplikacije, pa čak i rak.
07 Metode odabira transgeničnih organizama
Nisu sve stanice će zauzimati DNA tijekom preobrazbe. Bitno je da postoji metoda za otkrivanje onih koji to rade. Općenito, plazmidi nose gene za rezistenciju na antibiotike i transgene stanice mogu se odabrati na temelju ekspresije tih gena i njihove sposobnosti rasta na mediju koji sadrži taj antibiotik. Alternativne metode selekcije ovise o prisutnosti drugih reporterskih proteina kao što je x-gal / lacZ sustav ili zelenog fluorescentnog proteina, koji omogućuju odabir na bazi boje i fluorescencije.