Što PCR ima veze s DNA sekvenciranje i pojačavanje gena
Lančana reakcija polimeraze ( PCR ) je molekularna genetska tehnika za izradu višestrukih kopija gena i također je dio procesa sekvencioniranja gena.
Kako djeluje polimeraza lančana reakcija?
Genske kopije su napravljene pomoću uzorka DNK, a tehnologija je dovoljna za višestruke kopije iz jedne kopije gena koji se nalazi u uzorku. PCR amplifikacija gena za izradu milijuna kopija omogućava otkrivanje i identifikaciju sekvenci gena koristeći vizualne tehnike bazirane na veličini i naboju (+ ili -) dijela DNA.
Pod kontroliranim uvjetima, mali segmenti DNA generiraju se enzimima poznatim kao DNA polimeraze, koji dodaju pozdravni deoksinukleotidi (dNTPs) u komad DNA poznatog kao "predložak". Kao polazišta za polimerazu koriste se i manji dijelovi DNA, nazvanih "primeri". Primeri su male umjetne komadiće DNA (oligomeri), obično između 15 i 30 nukleotida. Oni su napravljeni poznavanjem ili nagađanjem kratkih sekvencija DNA na samim krajevima gena koji se pojačavaju. Tijekom PCR, sekvencionirana DNA zagrijava se i dvostruka niti odvoji. Nakon hlađenja, početnice se vežu na predložak (zove se žarenje) i stvaraju mjesto za početak polimeraze.
PCR tehnika
Lančana reakcija polimeraze (PCR) omogućena je otkrićem termofila i termofilnih polimeraznih enzima (enzima koji održavaju strukturalni integritet i funkcionalnost nakon zagrijavanja pri visokim temperaturama).
Koraci uključeni u PCR tehniku su kako slijedi:
- Mješavina je stvorena, s optimiziranim koncentracijama DNA predložaka, enzima polimeraze, primera i dNTPs. Sposobnost zagrijavanja smjese bez denaturacije enzima omogućava denaturiranje dvostruke spirale DNA uzorka na temperaturama u rasponu od 94 stupnjeva Celzijusa.
- Nakon denaturacije, uzorak se ohladi do umjerenijeg raspona, oko 54 stupnja, što olakšava žarenje (vezanje) klica na jednolančane DNK predloške.
- U trećem koraku ciklusa, uzorak se ponovo zagrije na 72 stupnja, idealnu temperaturu za Taq DNA Polymerase, za produljenje. Tijekom produljenja, DNA polimeraza koristi izvorni pojedinačni DNA lanac kao predložak za dodavanje komplementarnih dNTPs na 3 'krajeve svakog primera i generiranje sekcije dvolančane DNA u području gena od interesa.
- Primeri koji su se žalili na DNA sekvence koji nisu točno podudaranje ne ostaju zacrnjeni na 72 stupnjeva, čime se ograničava produljenje gena od interesa.
Taj proces denaturacije, žarenja i produženja ponavlja se više (30-40) puta, čime se eksponencijalno povećava broj kopija željenog gena u smjesi. Iako će ovaj postupak biti prilično dosadan ako se izvodi ručno, uzorci se mogu pripremiti i inkubirati u programabilnom Thermocycleru, sada uobičajenom u većini molekularnih laboratorija, a kompletna PCR reakcija može se provesti u 3-4 sata.
Svaki stupanj denaturacije zaustavlja proces elongacije prethodnog ciklusa, čime se skraćuje novi lanac DNA i drži ga približno veličinom željenog gena.
Trajanje ciklusa istezanja može biti dulje ili kraće, ovisno o veličini gen od interesa, ali na kraju, kroz ponovljene cikluse PCR, većina predložaka bit će ograničena samo na veličinu gena od interesa, jer oni će biti generirani iz proizvoda oba od primera.
Postoji nekoliko različitih čimbenika za uspješno PCR koji se mogu manipulirati kako bi se poboljšali rezultati. Najčešće korištena metoda za testiranje prisutnosti PCR proizvoda je elektroforeza agarozne gele . Koji se koristi za odjeljivanje DNA fragmenata na temelju veličine i naboja. Fragmenti se zatim vizualiziraju upotrebom boja ili radioizotopa.
Evolucija
Od otkrića PCR-a otkrivene su DNA polimeraze, a ne izvorni Taq. Neki od njih imaju bolju sposobnost "lektora" ili su stabilni pri višim temperaturama, čime se poboljšava specifičnost PCR-a i smanjuju pogreške pri umetanju netočnog dNTP-a.
Neke varijacije PCR su dizajnirane za specifične primjene i redovito se rabe u molekularnim genetskim laboratorijima. Neki od njih su PCR real-time i PCR reverzne transkriptaze. Otkriće PCR također dovodi do razvoja sekvencioniranja DNA , DNA fingerprinting i drugih molekularnih tehnika.