Podešavanje bilo koje komponente reakcije polimerazne lančane reakcije (PCR) može promijeniti kvalitetu ishoda, bilo poboljšavanjem ili smanjenjem prinosa i kvalitete proizvoda ili poboljšanjem specifičnosti i osjetljivosti reakcije. Parametri koji utječu na krajnji rezultat mogu biti fizički (tj. Temperatura, vrijeme ciklusa) ili kemijska (tj. Koncentracija predložaka, vrsta enzima koji se koristi). Slijedi nekoliko ključnih čimbenika koji utječu na uspjeh PCR-a.
01 Čist laboratorijski uvjeti
Budući da je PCR sposoban otkriti jednu molekulu DNA, važno je zadržati netaknute stanja u laboratoriju. Uvijek nosite svježe rukavice, koristite sterilne staklene posude, cijevi i pipete i sterilne otopine i očistite radno područje prije početka rada.
Uvijek uključite kontrolne reakcije, bez predložaka DNK i bez enzima, kako bi se osiguralo da rezultati zaista dođu zbog pojačanja pravog uzorka.
Većina ljudi pobrinite se da imaju vlastiti skup rješenja koja se ne dijele kako bi olakšala rješavanje problema i da su određene pipete često stavljene na stranu samo za PCR. DNase i RNase-free PCR cijevi, aerosol otporne pipete savjete i rad u dim zračenja s UV svjetlo također su načini kako bi se smanjili problemi.
02 Kemijske komponente
- Imaju 18 do 24 baze
- Nemate sekundarnu strukturu (tj. Petlje na vrhu)
- Imaju uravnoteženu distribuciju G / C i A / T parova
- Nisu međusobno komplementarne na kraju 3 stopa
- Temperatura taljenja (Tm) iznosi oko 5-10 stupnjeva Celzija ispod temperaturi žarenja, obično između 55 i 65 stupnjeva Celzija
Tm za oba primera također bi trebao biti sličan za najbolje rezultate.
03 Mix reakcije: Predložak i temeljni premazi
Optimalne koncentracije primera su između 0,1 i 0,6 mikromola / L. Količina predložaka varira ovisno o vrsti DNK (ljudski, bakterijski, plazmid).
Uz vrlo niske količine predložaka, postoje i druge strategije za poboljšanje rezultata, kao što su povećani broj ciklusa ili upotreba "vrućeg početka". Uvijek testirati nove primere s pozitivnom kontrolnom reakcijom, kako biste bili sigurni da rade u vašim specifičnim eksperimentalnim uvjetima.
04 Reakcijska smjesa: enzimska aktivnost
Koncentracija MgCl2 u reakcijskoj mješavini može utjecati na ishod PCR i može imati važnu ulogu u bržim reakcijama. Magnezijev kation formira topive komplekse s dNTPs kako bi se proizveo stvarni supstrat koji enzim polimeraze prepoznaje.
Jednake količine svih četiri dNTP-a također pomažu smanjiti brzinu pogrešaka polimeraze. Određeni aditivi kao što su betain, BSA, deterdženti, DMSO, glicerol i pirofosfataza također mogu utjecati na enzimsku specifičnost ili učinkovitost reakcije.
05 Vrsta Thermocycler
Kada kupujete laboratorijsku opremu, imajte na umu da su neki termocikli manje precizni od drugih u održavanju točnih, željenih temperatura.
Ovo je jedno područje na kojem se odlaskom na jeftinost neće dugoročno isplatiti kada se suočite s finickom reakcijom ili korištenjem prajmera koji zahtijevaju uski raspon temperature žarenja.
Reakcijske cijevi s tankim zidovima dizajnirane da odgovaraju preciznoj marki termocikla koji koristite, također pomažu u optimiziranju reakcijskih temperatura.
06 Postavke ciklusa
Povećan prinos može se postići povećanjem vremena produženja oko svakih 20 ciklusa, kako bi se nadoknadilo manje enzima za pojačavanje više predložaka. Obično je manje od 40 ciklusa dovoljno da se pojačaju manje od 10 molekula predložaka u koncentraciji dovoljno velikom da se vidi na agaroznom gelu obojanom etidij bromidom.