Stupanj potrebne proteinske čistoće ovisi o namjeravanoj krajnjoj upotrebi proteina.
Za neke primjene dovoljan je sirovi ekstrakt. Međutim, za druge namjene, kao što su hrana i lijekovi, potrebna je visoka razina čistoće. Da bi se to postiglo, obično se koriste nekoliko metoda pročišćavanja proteina, u nizu stupnjeva pročišćavanja.
Svaki korak pročišćavanja proteina obično rezultira određenim stupnjem gubitka produkta. Dakle, idealna strategija pročišćavanja proteina je ona u kojoj se postiže najviša razina pročišćavanja u najmanjim koracima. Odabir koraka za uporabu ovisi o veličini, naboju, topljivosti i drugim svojstvima ciljnog proteina. Sljedeće tehnike su najprikladnije za pročišćavanje jednog citosolnog proteina. Pročišćavanje kompleksa citosolnih proteina je složeniji i obično zahtijeva primjenu različitih metoda.
Prvi koraci za pročišćavanje proteina
Prvi korak u pročišćavanju unutarstaničnih proteina (unutar stanice) je pripravak sirovog ekstrakta .
Ekstrakt će sadržavati kompleksnu smjesu svih proteina iz stanične citoplazme, te neke dodatne makromolekule, kofaktore i hranjive tvari. Sirov ekstrakt se može koristiti za neke primjene u biotehnologiji, međutim, ako je čistoća problem, moraju se slijediti kasni postupci pročišćavanja.
Ekstrakti sirovih proteina se dobivaju uklanjanjem staničnih krhotina nastalih lizacijom stanica, koja se postiže korištenjem kemikalija i enzima , sonikacijom ili francuskim Pressom. Krhotine se uklanjaju centrifugiranjem, a supernatant se ponovno dobije. Sirovi pripravci ekstracelularnih proteina mogu se dobiti jednostavnim uklanjanjem stanica centrifugiranjem.
Za određene biotehnološke primjene postoji potražnja za termostabilnim enzimima : Enzimi koji mogu tolerirati visoke temperature bez denaturacije, a istodobno zadržavajući visoku specifičnu aktivnost. Organizmi koji ih stvaraju ponekad nazivaju extremofili. Jednostavan pristup pročišćavanju proteina otpornih na toplinu je denaturacija ostalih bjelančevina u smjesi zagrijavanjem, a zatim hlađenjem otopine (čime se omogućuje da se termostabilni enzim reformira ili ponovno otapa, ako je potrebno. Denaturirani proteini se mogu ukloniti centrifugiranjem.
Postupci za međuprodukt pročišćavanja
U prošlosti, zajednički drugi korak za pročišćavanje proteina iz sirovog ekstrakta bio je taloženjem u otopini s visokom osmotskom snagom (npr. Otopine soli). Nukleinske kiseline u sirovom ekstraktu mogu se ukloniti precipitiranjem agregata nastalih sa streptomicin sulfatom ili protamin sulfatom.
Precipitaciju proteina obično se vrši pomoću amonij sulfata kao soli.
Različiti će se proteini precipitiraju u različitim koncentracijama amonijevog sulfata . Općenito, proteini viših molekulskih masa precipitiraju se u nižim koncentracijama amonijevog sulfata. Taloženje soli obično ne dovodi do visoko pročišćenog proteina, ali može pomoći u uklanjanju nekih neželjenih bjelančevina u smjesi i koncentraciji uzorka. Soli u otopini se zatim uklanjaju dijalizom kroz poroznu celuloznu cjevčicu, filtraciju ili kromatografiju s gelom.
Moderni biotehnološki protokoli često iskorištavaju mnoge komercijalno dostupne setove koji nude gotova rješenja za standardne postupke. Pročišćavanje proteina često se provodi pomoću filtara i pripremljenih gel filtracijskih stupova. Sve što trebate učiniti je slijediti upute i dodati pravi volumen pravog rješenja i pričekati određenu duljinu vremena dok prikuplja eluant (što izlazi na drugom kraju stupca) u svježoj epruveti.
- Kromatografske metode mogu se primijeniti pomoću stupa na vrhu ili automatske HPLC opreme. Razdvajanje pomoću HPLC može se provesti reverznom fazom, ionskom izmjenom ili metodama isključivanja veličine, te uzorcima detektiranim diodnim poljem ili laserskom tehnologijom.
Vizualizacija proteina i procjena pročišćavanja
- Kromatografija na reverznoj fazi (RPC) odvaja proteine na temelju njihove relativne hidrofobnosti . Ova tehnika je vrlo selektivna, ali zahtijeva upotrebu organskih otapala. Neki proteini trajno su denaturirani otapalima i gube funkcionalnost tijekom RPC-a. Stoga se ova metoda ne preporučuje za sve aplikacije, osobito ako je potrebno da ciljani protein zadrži aktivnost.
- Ion-exchange kromatografija se odnosi na odvajanje proteina na osnovi punjenja . Stupci se mogu pripremiti za anionsku izmjenu ili kationsku izmjenu. Anionski stupci za izmjenu sadrže stacionarnu fazu s pozitivnim nabojem koji privlači negativno nabijene proteine. Kationski stupovi za izmjenu su obrnute, negativno nabijene kuglice koje privlače pozitivno nabijene proteine. Elucija ciljnog proteina se vrši mijenjanjem pH u koloni, što rezultira promjenom ili neutralizacijom nabijenih funkcionalnih skupina svakog proteina.
- Kromatografija isključivanja veličine ( gel filtracija ) odvaja veće bjelančevine od malih, budući da veće molekule putuju brže kroz umreženi polimer u kromatografskoj koloni. Veliki se bjelančevine ne uklapaju u pore polimera, dok manji proteini rade i traju dulje putovanje kroz kolonu za kromatografiju, putem njihove manje izravne rute. Eluat se skuplja u nizu cijevi koji odvajaju proteine na osnovi vremena eluiranja. Gel filtracija je koristan alat za koncentriranje uzorka proteina jer se ciljni protein skuplja u manjem volumenu eluacije nego što je u početku dodano u kolonu. Slične tehnike filtriranja mogu se koristiti pri proizvodnji velikih količina bjelančevina zbog njihove ekonomičnosti.
- Kromatografija afiniteta vrlo je korisna tehnika za "poliranje" ili završetak postupka pročišćavanja proteina. Kuglice u stupcu za kromatografiju su umrežene na ligande koji se specifično vežu na ciljni protein. Protein se zatim uklanja iz kolone ispiranjem s otopinom koja sadrži slobodne ligande. Ova metoda daje najčišće rezultate i najveću specifičnu aktivnost u usporedbi s drugim tehnikama.
- SDS-PAGE je poliakrilamidna gela elektroforeza, izvedena u prisustvu SDS (natrij dodecil sulfat) koja se veže na proteine dajući im veliku neto negativnu naboj. Budući da su nabori svih bjelančevina prilično jednaki, ova metoda odvaja ih gotovo u cijelosti na temelju veličine. SDS-PAGE se često koristi za testiranje čistoće proteina nakon svakog koraka u nizu. Kako se neželjeni proteini postupno uklanjaju iz smjese, broj bendova koji se vizualiziraju na SDS-PAGE gelu smanjuje, sve dok postoji samo jedan bend koji predstavlja željeni protein.
- Imunoblot je tehnika vizualizacije proteina primijenjena u kombinaciji s afinitetnom kromatografijom. Protutijela za određeni protein koriste se kao ligandi na koloni kromatografije afiniteta. Ciljni protein zadržava se na koloni, a zatim se uklanja ispiranjem kolone otopinom soli ili drugim sredstvima. Antitijela povezana s radioaktivnim ili bojilnim naljepnicama pomažu u otkrivanju ciljnog proteina kada se odvoji od ostatka smjese.
izvori:
Zubay G. 1988. Biochemistry, 2. izdanje. Macmillan Publishing Co., New York, NY, SAD.
Amersham Pharmacia Biotech. 1999. Handbook za pročišćavanje proteina, izdanje AB. Amersham Pharmacia Biotech Inc. New Jersey, SAD. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.